单细胞测序在皮肤领域中的应用

人鬼情

皮肤作为人体的第一道生理防线和最大的器官，时刻参与着机体的功能活动，维持着机体和自然环境的对立统一，机体的异常情况也可以在皮肤表面反映出来。皮肤具备着近乎完美的生理保护功能：如屏障作用、感觉作用、调节体温、吸收作用、分泌和排泄作用等，在维护机体的健康上，起到十分重要的作用。皮肤的生理功能受到损害，引起皮肤病。皮肤科疾病种类庞杂，病因复杂，且多存在动态发展的特点，给临床诊断和治疗方式带来很大的挑战，因此有必要在分子和细胞水平上进一步探索皮肤疾病的发生和发展进程。单细胞RNA测序是在单个细胞水平上对其含有的转录组信息进行测序分析，用于发现新的细胞亚型，揭示细胞异质性，监视疾病的动态发展过程，最终提高对组织、器官和生物复杂性的理解，已广泛应用于神经生物学、种系传播、器官生长、癌症生物学等多个领域。本文通过展示单细胞测序在皮肤领域的研究成果，帮助大家理解皮肤疾病的发生机制。
皮肤发育

人体皮肤通过结构适应以及与先天和适应性免疫系统的相互作用，为人体提供了水分流失和外界伤害的重要保护，皮肤在子宫内的水生环境中发育并起作用，但在出生后迅速适应一系列不同的生理和病原学挑战。目前对这种复杂的多细胞系统在发育过程中以及免疫介导的炎性疾病扰动时发生的变化知之甚少。Reynolds G等对来自发育中的人胎儿皮肤(受孕后7到10周之间的人类胚胎皮肤)、健康成年皮肤以及患有特应性皮炎和牛皮癣的成年皮肤的超过500,000个细胞进行单细胞转录组分析，首次在产前早期，成年期和炎症性皮肤病期间绘制了一份完整的人类皮肤图谱，揭示了在妊娠早期皮肤中先天免疫细胞的富集，以及湿疹和牛皮癣病相关淋巴细胞的克隆扩增，同时发现湿疹和牛皮癣患者的皮肤细胞与发育中的皮肤细胞有许多相同的分子途径，这对探究疾病原因提供了重要参考，并为治疗皮肤病提供了潜在的新药靶点。最后，在四个供体上用CyTOF在蛋白水平对细胞状态进行验证和频率估计，结果显示相关细胞状态的基因表达与CyTOF分析一致。

众所周知，细胞发育是一个动态发展的过程，已知巨噬细胞是皮肤中数量最多的免疫细胞，Kolter等在研究小鼠真皮巨噬细胞的发育及分化情况的过程中用单细胞测序发现，巨噬细胞可以细分成4个在抗原提呈和抗原活化能力存在显著差异的细胞亚群，且其中一个亚群是一种与感觉神经纤维作用的胚胎巨噬细胞，发现这些巨噬细胞在组织损伤时能促进神经再生。



产前早期，成年期和炎症性皮肤病期细胞图谱以及亚群细分

自身免疫疾病

白癜风(vitiligo)是获得性色素脱失性皮肤病，以表皮黑素细胞缺失而出现皮肤和黏膜白斑为特征。现代医学认为其与免疫功能、氧化应激、黑色素细胞自毀、遗传、神经化学因子等因素密切相关，但具体发病机制仍不明确，易诊难治，复发率高，严重影响了患者的生活质量和心理健康。林福全等收集2例健康人(无免疫及系统性疾病)正常皮肤和2例非节段型稳定期白癜风患者皮损样本，对所有样本的11,000个细胞进行单细胞转录组测序，这是国内首次报道通过单细胞测序手段研究白癜风皮损的转录表达谱，初步发现4群数量及功能差异的角质形成细胞，提示角质形成细胞亚群的异常分化与功能异常可能影响白癜风的发生发展。



单细胞亚群分类及分布 簇号0 ~ 11、17分别代表角质形成细胞亚群

Strassner等为了探究白癜风黑色素细胞的破坏机制，从6例活动期白癜风患者的皮损及非皮损皮肤以及6例健康人对照样本中分离出单细胞并测序，共鉴定出多种细胞亚群(黑素细胞、角质形成细胞、朗格汉斯细胞和免疫细胞等)，并发现了在白癜风中发挥作用的基因和配体-受体对，推测这些配体-受体对可能促进疾病进展。该研究还发现，朗格汉斯细胞可表达多种已知的与白癜风患病风险相关的等位基因，认为此类细胞能在白癜风发展中发挥重要作用，而此类细胞可成为白癜风治疗的新靶标。
其他皮肤疾病

特应性皮炎(Atopic dermatitis，AD)是一种常见的皮肤炎症性疾病，AD涉及皮肤免疫和屏障异常，包括T细胞和树突状细胞(DC)浸润、表皮增生和角化细胞分化紊乱。虽然整个皮肤活检提供了有关细胞因子的重要信息，但它们并没有很好地定义原始细胞类型，基于单细胞水平上的研究还是未知。Hh A等从5例AD患者(4例损伤样本，5例非损伤样本)和7例健康对照者的皮肤活检样本进行了单细胞RNA测序，共得到39042个细胞，构建了健康、非损伤和损伤皮肤的单细胞图谱，成纤维细胞显示了一种新的COL6A5+COL18A1+亚群，这是损伤AD样本的特异性亚群，并表达CCL2和CCL19细胞因子。表达CCL19受体CCR7的相应的LAMP3+树突状细胞(DC)群在AD病变中也是独特的，说明成纤维细胞向免疫细胞发出信号的潜在作用。损伤的AD标本以炎性DCs(CD1A+FCER1A+)和组织驻留记忆T细胞(CD69+CD103+)的扩增为特征。2型(IL13+)/22型(IL22+)T细胞的比例在损伤AD中高于1型(IFNG+)，而在非损伤AD中这一比例略有下降，在对照组中也进一步下降。



在损伤AD中发现新的成纤维细胞亚群(COL6A5+COL18A1+)

皮肤创伤愈合

在成年小鼠皮肤伤口愈合过程中，毛囊和脂肪细胞再生。脂肪细胞由肌成纤维细胞再生，这是一种特殊的可收缩的创伤成纤维细胞。Guerrero-Juarez C F等采集了小鼠创伤后12天伤口真皮21819个细胞，使用单细胞RNA测序研究创伤成纤维细胞的多样性。分群发现成纤维细胞组分为12个簇，拟时序和RNA速率分析显示，一些簇可能代表向可收缩表型的连续分化状态，而其他簇似乎代表不同的成纤维细胞谱系。一部分成纤维细胞表达造血标记，提示其起源于髓系。同时使用单细胞蛋白印迹和单细胞RNA测序对基因标记的肌成纤维细胞进行验证。利用骨髓移植和基于Cre的重组谱系追踪实验，排除了细胞融合事件，并证实造血谱系细胞产生了一部分肌成纤维细胞和罕见的再生脂肪细胞。综上所述，损伤诱导成纤维细胞间高度异质性，并招募高可塑性的髓细胞参与脂肪细胞再生。



成纤维细胞进行二次聚类可得到12个亚群(sC1 ~ sC12)

皮肤感染

寻常痤疮(Acne vulgaris)是一种常见的皮肤病，由痤疮丙酸杆菌感染引起毛囊发炎，会导致疼痛、疤痕形成，甚至产生肉芽肿，降低生活质量。寻常痤疮的炎症伴随着皮脂分泌增加、皮肤异常角质化及痤疮丙酸杆菌毛囊定植。病变皮肤周围大量T淋巴细胞和中性粒细胞浸润，导致毛囊壁破裂，加剧炎症反应。研究表明，CD11c+DC对热灭活痤疮丙酸杆菌感染小鼠肝脏中的肉芽肿形成至关重要，但DC在皮肤痤疮丙酸杆菌感染中的作用尚不清楚。新加坡科技研究局(A*STAR)首席研究员Florent Ginhoux教授团队在Immunity上发表文章，通过研究野生型小鼠痤疮丙酸杆菌注射16h后67个真皮cDC1单细胞的转录组学发现，细菌感染皮肤后，真皮中存在一个经典树突状细胞的亚群(cDC1s)——表达高水平CD59、EpCAM和Ly-6D，可产生血管内皮生长因子VEGF-α，正向调控中性粒细胞在炎症部位的持续募集、存活和功能。研究结果揭示了皮肤中DC亚群的新功能，有助于开发治疗寻常痤疮和其他细菌感染的新分子靶标。



单细胞测序测序揭示 P. acnes感染真皮中 cDC1s 的两个亚群

结  语   

鉴于单细胞测序在分析细胞异质性、细胞间相互关系的独特优势，该技术已经成为科研工作者的得力工具，大幅推进了对于疾病分子机制的认知，高效解决了细胞组成分析上的难题。为了帮助大家进一步进行数据挖掘和临床意义解读，新格元搭建了单细胞数据库SynEcoSys™，定期收录各大主流期刊文章中的细胞类型Marker基因来完善数据库。除了常规的人和小鼠的Marker，我们还收录了神经领域中常用物种恒河猴的Marker， 能够更加准确的定义相关样本中的细胞。新格元生物科技有限公司作为一家新兴的单细胞测序企业，致力于为客户提供全方位、一站式单细胞测序平台产品，提供优质、专业且全面的服务，让单细胞组学更好的应用于精准医疗和健康管理等领域。
参 考 文 献

[1] Reynolds G , Vegh P , Fletcher J , et al. Developmental cell programs are co-opted in inflammatory skin disease[J]. Science, 2021, 371(6527):eaba6500
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[3] Griffin, M. F., desJardins-Park, H. E., Mascharak, S., Borrelli, M. R. &Longaker, M. T. Understanding the impact of fibroblast heterogeneity on skin fibrosis. Dis. Models Mech. 13, dmm044164 (2020)
[4] 林福全, 洪为松, 周妙妮,等. 非节段型白癜风患者皮损单细胞转录图谱的初步研究[J]. 中华皮肤科杂志, 2020, 53(04):259-265.
[5] Strassner JP, Gellatly KJ, Rashighi M, et al. Dissecting autoimmune signaling networks in vitiligo using single-cell RNA-sequencing of cells isolated directly from lesional skin［J］. J Invest Dermatol, 2018,138（5, Suppl）:S18. doi: 10.1016/j.jid.2018.03.107.
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